Hiện nay, có hơn 500 loài côn trùng trên thế giới đã kháng với hóa chất diệt côn trùng, trong đó có hơn 50 loài muỗi sốt rét Anophelescó vai trò quan trọng trong chu trình lan truyền ký sinh trùng sốt rét cho con người. Kháng hóa chất diệt côn trùng đã được báo cáo ở các véc tơ sốt rét chính trên toàn thế giới. Tuy nhiên tình trạng muỗi kháng với hóa chất phân bố không đồng đều giữa các véc tơ và có thể khác nhau rất lớn giữa các làng, tỉnh, quốc gia, khu vực và châu lục trên phạm vi toàn cầu.

Song, có một vấn đề đáng báo động đó là muỗi kháng hóa chất diệt côn trùng mức cao nhất được báo cáo xảy ra ở châu Phi, nơi mà gánh nặng sốt rét vẫn cao nhất trên thế giới. Pyrethroid - một nhóm hóa chất diệt côn trùng được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc sử dụng cho màn tẩm hóa chất tồn lưu lâu dài (Long lasting insecticide treated nets-LLINs) và phun tồn lưu trong nhà (Indoor residual spraying-IRS). Chính việc sử dụng rộng rãi hóa chất diệt côn trùng đã làm cho quần thể muỗi sốt rét kháng và đe dọa những thành tựu đã đạt được trong việc kiểm soát bệnh sốt rét.

Hiện nay giám sát kháng hóa chất diệt côn trùng hầu hết phụ thuộc vào thử nghiệm sinh học, bằng cách sử dụng cố định các nồng độ hóa chất diệt côn trùng và thời gian tiếp xúc. Kết quả thử nghiệm sinh học được báo cáo bằng tỷ lệ phần trăm muỗi chết và hiệu quả muỗi ngã gục (Knock Down - KD). Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization_ WHO) đã xác định các liều lượng thử nghiệm (tức là liều gây chết 100% muỗi nhạy ở một loài nhất định sau khi tiếp xúc với hóa chất) cho hầu hết các loại hóa chất sử dụng trong phòng chống véc tơ sốt rét và sản xuất bộ dụng cụ để kiểm tra tính nhạy cảm của muỗi bao gồm dụng cụ tiếp xúc với hóa chất và giấy lọc tẩm với hóa chất diệt côn trùng.

Các bước thực hiện thử nghiệm đơn giản và kết quả thử nghiệm liều lượng sẽ cung cấp thông tin về kháng hóa chất tại các địa phương.

Hiện có ít nhất 3 phương pháp quan trọng để phát hiện các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng trên thế giới gồm thử nghiệm sinh học (Bioassays), thử nghiệm sinh hóa (Biochemical bioassay) và thử nghiệm phân tử (Molecular test). Cần chú ý, không có phương pháp nào trong số các phương pháp hiện nay phù hợp cho việc phát hiện kháng biểu bì (kháng do giảm tính thẩm thấu) và kháng tập tính (behavioural resistance).

Thường xuyên theo dõi muỗi kháng hóa chất diệt côn trùng là điều cần thiết để có các phản ứng chủ động nhằm ngăn ngừa khánghóa chất diệt côn trùng lan rộng và ảnh hưởng đến chương trình phòng chống véc tơ.

Các phương pháp phát hiện kháng hóa chất diệt côn trùng

Thử nghiệm sinh học (Bioassays)

Hướng dẫn các bước thực hiện thử nghiệm và diễn giải kết quả thử nghiệm được miêu tả trong tài liệu của WHOPES3 (truy cập http://www.who.int/whopes/resistance/eng/). Điều quan trọng là những cá thể muỗi được sử dụng trong thử nghiệm sinh học phải đạt tiêu chuẩn về độ tuổi, giới và trạng thái sinh lý vì tất cả các yếu tố này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Các cá thể trưởng thành có đặc trưng là phát triển từ những cá thể muỗi cái giống nhau hoặc từ thế hệ F1 được sử dụng để kiểm tra tính kháng hóa chất. Thử nghiệm ở các liều lượng được thực hiện đơn giản và cung cấp các bộ dữ liệu chuẩn hóa, giả định các nguyên tắc thử nghiệm được tuân thủ, điều này có thể dễ dàng so sánh để xác định thời gian và / hoặc sự thay đổi địa lý tình trạng kháng hóa chất của các quần thể véc tơ sốt rét.

Tuy nhiên, quan trọng là nhận ra một số hạn chế của phương pháp thử nghiệm tính nhạy cảm này. Duy nhất một nồng độ hóa chất diệt côn trùng được sử dụng, kết quả không cung cấp bất kỳ thông tin nào về mức độ kháng hóa chất của quần thể muỗi. Ví dụ, nếu 50% quần thể A và 20% quần thể B được giết chết sau khi tiếp xúc với nồng độ permethrin thử nghiệm thì không thể kết luận quần thể B kháng hóa chất hơn quần thể A.

Kết quả này chỉ nói lên rằng cả hai quần thể đều kháng hóa chất (theo tiêu chuẩn của WHO nếu tỷ lệ muỗi chết dưới 80% thì xác định quần thể muỗi đã kháng với hóa chất diệt côn trùng) và tùy thuộc vào ý nghĩa các thử nghiệm, tầng suất kháng ở các cá thể trong quần thể B cao hơn quần thể A. Các thử nghiệm đáp ứng liều lượng là cần thiết để so sánh các mức độ kháng hóa chất diệt côn trùng ở hai quần thể (ví dụ, đo lường tỷ lệ kháng và khoảng tin cậy 95%). Đối với các hóa chất nhóm pyrethroid, thời gian ngã gục trung bình cũng là một biến định lượng hữu ích. Tương tự như vậy, các kết quả thử nghiệm này không thể được sử dụng để so sánh các mức độ kháng đối với hai loại hóa chất diệt côn trùng khác nhau. Nếu tỷ lệ muỗi chết là 50% sau khi tiếp xúc với nồng độ hóa chất thử nghiệm permethrin (0.75%), trong khi đó nếu tỷ lệ chết 70% sau khi tiếp xúc với hóa chất deltamethrin ở liều lượng thử nghiệm (0.05%) thì không thể kết luận quần thể muỗi kháng với permethrin cao hơn so với deltamethrin. Một lần nữa, tất cả những gì có thể kết luận đó là quần thể muỗi đã kháng với cả hai loại hóa chất diệt côn trùng.

Một phần là do giới hạn của liều lượng thử nghiệm được miêu tả như trên và một phần do khó khăn mà đôi khi phát sinh trong việc có được một nguồn cung cấp giấy thử tẩm hóa chất thường xuyền từ WHO, một phương pháp thử nghiệm sinh học thay thế đã được phát triển và đang được chấp nhận ở một số chương trình giám sát. Phương pháp này được gọi là thử nghiệm sinh học bằng chai CDC (CDC bottle bioassay), sử dụng chai thủy tinh chứa đựng một nồng độ hóa chất diệt côn trùng biết trước. Những bộ dụng cụ thử nghiệm được lắp rápbởi những người thực hiện trong phòng thí nghiệm, nồng độ hóa chất diệt côn trùng có thể dễ dàng điều chỉnh cho phép liều lượng đáp ứng để so sánh hai hay nhiều chủng khác nhau. Lời cảnh báo cho điều này đó là sự linh hoạt và khả năng thay đổi ở các lớp hóa chất diệt côn trùng được sử dụng trong các thử nghiệm, làm suy yếu kết quả so sánh giữa hai nghiên cứu riêng biệt.

Thử nghiệm chai CDC và thử nghiệm các liều lượng chẩn đoán của WHO cả hai có thể được thay đổi để các chất hỗ trợ kết hợp chặc chẽ. Các chất hỗ trợ như piperonyl butoxide ngăn chặn hoạt động của hai họ men giải độc tố chính, có thể được sử dụng để khám phá vai trò các cơ chế kháng khác nhau. Nếu kháng hóa chất là do gia tăng chuyển hóa thì tiếp xúc với một chất hỗ trợ thích hợp trước khi thử nghiệm với hóa chất diệt côn trùng sẽ làm gia tăng mức độ chết của côn trùng.

Thử nghiệm sinh hóa (Biochemical test)

Thử nghiệm hóa sinh nhằm mục đích phát hiện các hoạt động biến đổi của các loại men liên quan đến kháng hóa chất diệt côn trùng có sẵn trong hơn hai thập kỷ qua và thỉnh thoảng được sử dụng kết hợp với phương pháp thử nghiệm sinh học hóa chất diệt côn trùng. Những thử nghiệm này sử dụng kiểu chất nền để ghi nhận toàn bộ hoạt động của các men glutathione transferases, carboxylesterases hoặc cytochrome P450s ở từng cá thể côn trùng riêng biệt. Thử nghiệm hóa sinh cũng có sẵn để phát hiện kháng vị trí đích đối với hóa chất thuộc nhóm phosphat hữu cơ, carbamate nguyên nhân là không nhạy acetylcholinesterase. Các phản ứng enzyme tạo ra sự thay đổi màu sắc điều này có thể nhìn thấy bằng mắt thường và do vậy các thử nghiệm này không yêu cầu tiếp cận các thiết bị đắc tiền (quang phổ thích hợp). Tuy nhiên, điều quan trọng là những cá thể muỗi khi thu thập phải được bảo quản lạnh từ những điểm thu thập để thực hiện thử nghiệm và điều này có thể thường gây ra những thách thức liên quan đến công tác hậu cần bảo quản mẫu. Hơn nữa, có các vấn đề về nhạy cảm và độ đặc hiệuđiều này hạn chế những tiện ích của một số thử nghiệm này. Ví dụ, có hơn 100 enzym cytochrome P450 khác nhau ở các vec tơ sốt rét, một thử nghiệm đo lường toàn bộ mức độ hoặc hoạt tính của họ enzyme này không thể có, sự nhạy cảm để phát hiện đối với một enzyme duy nhất hoặc một lượng nhỏ các enzyme P450 được cho là tham gia vào sự trao đổi chất pyrethroid. Điều này có thể giải thích thiếumối tương quan đáng kể được quan sát thấy trong nhiều nghiên cứu giữa hoạt động cytochrome P450 và kết quảmuỗi chết khi thử nghiệm sinh học. Ngoài ra không phải tất cả enzyme sẽ có cầu trúc giống nhau cho các chất bỗ trợ được sử dụng trong các thử nghiệm này (ví dụ. CDNB - 1-chloro 2-4, dinitrobenzene) là những chất bỗ trợ tiêu biểu được sử dụng để đánh giá hoạt tính của glutathione transferase những lớp Epsilon của GSTs mà chịu trách nhiệm cho kháng DDT có hoạt động tương đối thấp với chất bỗ trợ này). Để mà kết hợp chặc chẽ số liệu từ giám sát kháng dựa vào bằng chứng để đưa ra các quyết định can thiệp kiểm soát véc tơ dựa vào hóa chất diệt côn trùng, điều đó rất cần thiết trong kế hoạch kiểm soát véc tơ truyền bệnh. Mặc dù các hướng dẫn để tiến hành các thử nghiệm có sẵn là khác nhau, có rất ít sự đồng ý về số lượng các điểm và tần suất giám sát kháng hóa chất nên xảy ra. Rõ ràng kháng hóa chất là một đặc tính không ngừng thay đổi và có sự biến động lớn ở các mức độ kháng thông qua lan truyền sốt rét theo mùa đã được báo cáo. Khánghóa chất cũng có thể rất trọng tâm, đặc biệt là khi thành phần véc tơ khác nhau giữa các điểm, do đó một số lượng điểm lấy mẫu tối thiểu phải được thành lập, tham gia vào được coi là các mẫu phân bố véc tơ và sử dựng hóa chất diệt côn trùng.

Mạng lưới kiểm soát véc tơ kháng hóa chất châu Phi WHO/AFRO được thành lập vào năm 2000 với nhiều mục tiêu quan trọng, trong đó mục tiêu quan trọng nhất là cải thiện số liệu kháng hóa chấtđược công bố. Vì vậy, một cơ sở dữ liệu được thành lập để lưu trữ tất cả các kết quả của các hoạt động giám sát kháng hóa chất của các véc tơ sốt rét do các thành viên của Mạng lưới kháng hóa chất ở châu Phi (ANVR) thực hiện, nhưng cho đến nay, cơ sở dữ liệu này không phải dễ dàng để người ngoài truy cập vào. Việc thành lập cơ sở dữ liệu mới gần đây được xem như là một nguồn dữ liệu tập trung trực tuyến cho việc thu thập các dữ liệu về kháng hóa chất ở các véc tơ truyền bệnh và kết hợp dữ liệu này vào cơ sở dữ liệu của ANVR, hi vọng sẽ đảm bảo rằng cả dữ liệu kháng đã công bố và chưa công bố ở các véc tơ sốt rét là có sẵn để cho tất cả các những cá nhân, tố chức quan tâm tiếp cận.

Thử nghiệm phân tử (Molecular test)

            Nhiều thử nghiệm phân tử đã được phát triển để phát hiện các alen kdr ở các loài muỗi sốt rét, một trong số các phương pháp đó gần đây đã được so sánh trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Bass và cộng sự (2007). Những phương pháp này thường xuyên được sử dụngbởinghiên cứu giám sát phòng thí nghiệm đối với kháng hóa chất diệt côn trùng và đang dần được tích hợp vào một số chương trình giám sát kháng hóa chất trong phòng chống sốt rét quốc gia. Tuy nhiên, mặc dù gần đây đã xác định được các enzym chính liên quan đến kháng do chuyển hóa pyrethroid ở loài muỗi An gambiae và An funestus, hiện tại không có thử nghiêm dựa vào DNA sơi đơn để phát hiện các cơ chế đề kháng này. Phát hiện các gen này hiện nay phụ thuộc vào các phương pháp dựa trên ARN sử dụng thiết bị tương đối phức tạp (ví dụ như RTqPCR).

Thử nghiệm để phát hiện các đột biến di truyền liên quan đến kháng kiểu hình ở những cá thể côn trùng có thể cung cấp một cảnh báo sớm về sự xuất hiện kháng hóa chất mà có thể không được phát hiện bằng phương pháp thử nghiệm sinh học vì phương pháp thử nghiệm sinh học chỉ có thể ghi lại các phản ứng của quần thể côn trùng.

Sự có mặt của một alen ở từng cá thể để bàn luận kháng hóa chất nên đây là lý do để tập trung, vì vậy kinh nghiệm đã chỉ ra rằng kháng hóa chất có thể lan rất nhanh trong quần thể trừ khi áp lực chọn lọc được giảm xuống hoặc hoặc giảm di truyền liên quan với alen kháng cao. Ngược lại, một kết quả âm tính từ các thử nghiệm phân tử không nên dẫn đến sự tự mãn.

Như đã thảo luận ở trên, hiện nay thử nghiệm phân tử chỉ thích hợp đối với kháng do thay đổi vị trí đích và thất bại trong việc phát hiện kdr rõ ràng không thể diễn giải như là một sự vắng mặt của kháng hóa chất trong quần thể. Do đó xét nghiệm phân tử nên được xem như một sự bổ sung chứ không phải là một phương pháp thay thế cho phương pháp thử nghiệm sinh học.